摘要 生物芯片技术是近年来发展起来的分子生物技术，是各学科交叉综合发展的产物。以其分析检测过程中的高通量、微型化和自动化的特点显示它具有远大的应用和发展前景,尤其在法医物证检验方面倍受青睐。本文主要介绍了生物芯片在遗传标记的应用、遗传标记多态性评估、物证鉴定中的应用方面的研究。同时，对生物芯片技术在法医物证鉴定中的应用前景进行了较为客观的评价。
关键词 生物芯片技术 法医物证学 PCR技术 单核苷酸多态性（SNP）
法医物证学是研究和解决司法实践中有关生物检材的法医学鉴定以及亲权鉴定等问题的一门科学。其主要任务是通过人类遗传标记的检测与分析进行个体识别与亲子鉴定。个人识别又称同一性鉴定。现代刑事犯罪理论认为，接触就会遗留痕迹。刑事犯罪是一个客观过程，从刑事案件现场收集到罪犯遗留的生物学检材，如血痕、精斑、唾液、毛发等均是证实犯罪的物证。通过现场材料和犯罪嫌疑人的遗传标记的检测与比对，可以达到排除或认定罪犯的目的。法医学亲子鉴定是通过对假设父亲、母亲和孩子的遗传标记的检测，分析亲代与子代间是否符合遗传规律，判断是否亲生关系。鉴定所用方法包括形态学、化学及生物化学、免疫血清学、分子生物学、人类学及遗传学等多种方法。当前，随着人类基因组计划（HGP）的实施和完成,利用基因组序列信息发展起来的一些新技术引发了目前生物医学研究领域的革命。在这些新技术中,以DNA芯片为代表的生物芯片(bio-chip)技术克服了传统技术的诸多缺点，成为当前法医物证学研究领域最有生命力、最前沿的新技术。
1 遗传标记应用现状
1.1 法医物证学应用的传统遗传标记是血型，进入20世纪80年代,遗传标记的分析进入DNA分析水平。1985年，法医DNA的限制性片段长度多态性（restriction frag-ment length polymorphism,RFLP）检测方法建立,检测手段主要是Southern杂交。采用人类小卫星DNA核心序列作为探针，在低强度杂交条件下,同时与多个可变数目串联重复序列（variable number of tandem repeats,VNTR）基因座形成杂交产物。杂交形成的RFLP图谱由十数条不同的片段长度组成，形似商品上标记的条码。图谱具有高度个体特异性，不同个体间片段数不同、片段长度不同，无关个体间的平均匹配概率达到10-12～10-19。DNA-RFLP检测使法医学第一次能够认定同一性，因此小卫星DNA-RFLP分析被誉为DNA指纹。DNA指纹技术克服了血型标记检测的局限性,在案件调查中发挥了重要作用。多年的实践应用发现，DNA—RFLP检测方法烦琐，检测时间长，检测灵敏度低，有关结论解释的理论基础尚待完善，在实际案件材料的检测应用时受到限制。
1.2 第二代DNA遗传标记是应用PCR技术扩增人类基因组中VNTR序列。在卫星DNA中，VNTR大约占一半，具有串联重复的特征性序列，以相对恒定的序列片段作为重复单位，在某个基因座串联重复。不同个体、不同等位基因间表现为重复的次数不同，构成复杂的片段长度多态性。目前，法医DNA分型检测常规采用微卫星DNA-VNTR序列遗传标记，这类卫星序列的重复单位长2～6bp，重复次数由数次到数十次，等位基因片段长度均在400bp以下，故称短串联重复序列（short tandem repeat,STR）。PCR-STR分型具有高灵敏度、高多态性的优势，适用于腐败、陈旧检材的法医学鉴定。荧光标记PCR-STR分型已成为法医物证鉴定的标准技术。
1.3 第三代DNA遗传标记是应用单核苷酸多态性。1997年，单核苷酸多态性(sing-le nucleotide polymorphism,SNP)标记的提出，在整个生物学界、法医学界引起一个DNA多态性研究的新热潮。 SNP是指基因组内某特定的核苷酸位置上存在有2种不同的碱基成分，按照多态性的概念，其中少的一种碱基在群体中的比例不少于1%。与STR相比,SNP在基因组中有更广泛地分布，如果按照0.5%～10%的碱基变异率计算，人类基因座中至少每1kb就有一个SNP，总SNP数至少300万，分布密度远多于其他DNA遗传标记。由于选择压力的原因，包括SNP在内的碱基序列变异在非编码区的分布要远多于编码区，尽管如此，估计人类编码区的SNP大约也要20万个。从生物遗传和变异的本质分析,SNP将是一种最能反映群体遗传结构和个体间的遗传差异标记系统。SNP是单个核苷酸变异形成的DNA序列多态性，理论上一个核苷酸位置可以有4种碱基变异形式，但实际上SNP多表现为双等位基因，即二态性遗传变异。
SNP的多态性程度虽远不如小卫星或微卫星，但是SNP数量巨大，基因组中分布频密，从整体而言，SNP的多态性实际上要大得多。由于SNP位点均为二等位基因，在SNP检测时能通过简单的‘+/-’方式进行表型分析，无须测定基因片段的长度，检测结果易于自动化。SNP将成为法医物证鉴定应用的第三代遗传标记系统。它大约包含了人类基因组中已知多态性的80%,是最常见的遗传变异形式，在人类基因组学、医学遗传学、疾病相关性研究，药物敏感性相关基因研究以及法医学等方面将发挥重大作用。
2 遗传标记系统多态性评估的研究
2.1 为了达到较高的识别能力,法医学选择遗传标记时通常首选高多态性标记系统。多态性程度高，识别能力高，法医学鉴定中的实用价值就高。评估多态性高低通常用的遗传学指标有杂合度（heterozygosity,H），法医学应用评估指标有个体识别能力（discrimination power,DP）和非父排除率（probability of exclusion,PE）。三个评估指标均可通过相应的计算公式计算。影响多态性高低主要有两个因素：一是基因座上的等位基因数；二是群体中等位基因频率分布。一般情况下，遗传标记系统的等位基因数越多，等位基因频率分布越平均，多态性程度越高。
2.2 选择高多态性遗传标记的目的是鉴定结论能够达到绝对认定或绝对排除。法医学个体识别鉴定和亲子鉴定结论都是双向性的，要么排除同一性或亲子关系，要么是认定同一性或亲子关系。选择高多态性遗传标记的目的是要求达到遗传表型具有高度的个体特异性，鉴定论能够认定是绝对的、排除也是绝对的。虽然从统计学理论分析不可能达到这一终极目标，但当某一基因表型是极其罕见的小概率事件时，接近的绝对排除或认定结论是有可能的。例如某现场的精斑与嫌疑人的检材经过12个STR基因座检测，所有的基因型均相同，计算累计匹配概率为10－13，意思是在一千亿个无关个体中，此遗传表型是惟一的，此时认定嫌疑人是罪犯应毫无疑问。当一个嫌疑父亲在检测了13个STR基因座后,仍不排除他是有争议孩子的亲生父亲，计算似然率超过2000，父子关系相对机会超过99.95%，认定亲生关系也应无疑义。累计平均匹配概率10－13，累计非父排除率达0.9995是目前国际上通行的统计学衡量指标。
2.3 法医物证学应用所关注的问题是要达到一个公认的规范的鉴别能力标准。要达到一个公认的规范的鉴别能力标准，至少要检测遗传标记系统，这既是法医物证学应用所关注的问题，同时也是法医物证学近年来研究的热点和难点问题。法医物证学应用选择的STR基因座，等位基因数一般在10～20个，杂合度0.7左右，多态性程度较低,复合扩增13～16个基因座一般能达到鉴定要求。SNP座位为二等位基因结构,同步检测多少个SNP才能达到专业衡量指标，从多态性理论推算或实际案件检测的角度分析，SNP基因座检测的基本数目应予确定。
Delahunty等（1996）首次应用寡核苷酸连接试验(oligonucleotide ligation assay, OLA)对多SNP基因座同步分析进行了尝试。针对每一个SNP,设计有检测探针和示踪探针，均含约20个核苷酸，分别用同位素32P标记。OLA反应中，先行扩增样品DNA，两种探针均与样品扩增产物杂交。作者选择了11条染色体上的19个SNP基因座：AT3，PROS1，BCHE，ARSB，CG26，VB14，VB6.9,TYR,IGF2,VWF,COL2A1,F7，CA3,HT3,VA28,VA23,BCL2,LDLR和PRNP。每个位点的两个等位基因，相应设计的2个检测探针均用生物素标记,示踪探头采用dUTP-毛地黄毒苷标记，显色反应利用抗毛地黄毒苷抗体-ELISA系统。阳性为深红色，阴性为无色，以微反应板色谱计测定490nm处的吸收光谱值，大于0.15为阳性,小于0.15为阴性。检测结果转化为数字：基因1阳性、基因2阴性、基因型的个体为1型；基因1阴性、基因2阳性者，基因型个体为2型；基因1、2均为阳性杂合子个体为3型；基因1、2均为阴性为4型，其中4型代表PCR扩增失败，此型占总个体数不到1%。根据群体调查确定19个SNP座位的二基因频率比值平均为62∶38，计算出19座位的累计平均匹配概率为4.8×19-9。
Brenner（2001）认为,达到法医鉴定需要的鉴别能力，至少需要多少个标记系统，受多因素影响。对于个体识别鉴定而言，一个单基因座VNTR－RFLP系统相当于3个ATR或者12个SNP，如果用于典型的混合斑个人识别鉴定，这个比率则为1∶4∶27。目前学术界基本能接受的意见是，个体识别鉴定需要50个常染色体ANP，亲子鉴定要100个SNP基因座，才能达到目前PCR—STR分析系统的鉴别能力。发现与确定SNP基因座目前不是难题,现在公共数据库中已经有100万个以上的SNP（http：//snp.chsl.org/）。利用生物芯片技术检测展示的多SNP组合，单从多态性程度而言,50～100个SNP基因座组合在理论上可以获得可靠的鉴别力,不过，在案件鉴定中的信息可信度还要通过实践的应用评估。
3 生物芯片技术在物证鉴定中的应用
由于生物芯片技术使核酸杂交实现集成化、高通量，一次性对样品大量序列进行实时、灵敏、准确的检测与分析，开拓了一个同步检测多个遗传标记系统的新技术，在法医物证鉴定中将发挥重要的作用，而样品制备芯片和生化反应芯片（PCR芯片）在法医物证学的应用研究也有一定的发展。
3.1 微量核酸样品的制备 在法医实践中经常遇到样品量稀少的情况,用传统的方法进行核酸的分离和纯化非常困难，它包括了细胞分离、破胞、脱蛋白、提取DNA、PCR等方面的工作。而生物芯片的构造特点决定了在生物芯片上进行样品制备只需要极微量的样品,这在法医DNA分析中具有很高的实用价值。宾夕法尼亚大学的研究小组研究的一种微量过滤芯片已经能够从血液中得到高收率的人白细胞。为了把不同的癌细胞、细菌或病毒从血样、水样或其他液体样品中分离出来，人们设计加工了介电电泳（dielectroporesis）芯片，用该芯片已成功实现了对乳腺癌细胞和正常单核细胞的分离。芯片中的破胞方法有芯片升温破胞、变压脉冲破胞，以及化学破胞等。在捕获DNA方面，Cepheid公司应用湿法蚀刻、反应离子蚀刻和等离子蚀刻等技术，在硅片上加工出含有5000个高200μm、直径20μm的具有细柱式结构的DNA萃取芯片，专门用于提取低浓度（低于105个目标DNA）和高浓度（100～1000ng/ml量级）的DNA。目前，Cepheid公司已经开发出功能更强大的样品制备芯片。由于生物芯片样品制备技术和芯片PCR技术所需样品量少、反应速度快、无交叉污染,所以，该技术用于法医DNA分析将大大提高法医物证鉴定的速度和鉴定结果的准确性。
3.2 STR基因座分型检测 STR分型是目前法医学鉴定的主要手段,常规采用多座位复合扩增方法提高单次检测的信息量，累计多个基因座的鉴别信息，可以达到10-12的平均匹配概率。STR座位片段长度等位基因的鉴别需要高分辨的电泳技术，区别数bp长度差异的基因，技术要求较高。应用芯片技术可以避免电泳程序可能出现的误差，应是一项有前途的技术手段。
传统的被动杂交不能保证杂交的均一性和忠实性，操作难度大，过程繁琐费时。Radtkey等（2000）根据DNA杂交原理，利用不同碱基对积能（stacking energy）的差异，设计由电场控制的主动杂交微阵列系统检测TH01和CSF1PO两个STR基因座获得成功。该技术的主要优点是利用电场作用，完成探针与靶DNA片段的主动杂交过程。在人为控制的高强度杂交条件下，避免了芯片寡核苷酸阵列中重复序列位置上的滑动杂交产物形成。该方法解决了两个关键技术问题。一是在电场的控制下，完成捕获分子的定位和靶DNA片段的杂交,同时具有浓缩寡核苷酸的作用，提高杂交效率和检测的灵敏度，50ng模板DNA就可以完成STR分型检测。电杂交明显缩短了检测时间,捕获分子与靶基因片段杂交可以在5分钟内完成；另一个是针对各不同等位基因设计捕获分子，是准确检测出等位基因的关键因素。电场控制的主动杂交DNA芯片技术分析多STR基因座，理论上的论证是可行的，但是有关STR基因座的选择与组合以及该方法能否适用于各类陈旧、 微量、腐败生物学检材的检验鉴定，目前尚在研究中。
3.3 SNP基因座分型检测 SNP在基因座中具有高密度分布,具有稳定的遗传。从法医物证学检验的要求分析，为了达到最大的鉴别力,选择SNP应遵循以下几个原则：①等位基因频率在0.2～0.8之间。有作者研究，利用基因频率为0.2～0.8的SNP标记构建高密度的基因遗传图谱，效果与0.5/0.5频率分布的SNP无明显差异。②SNP座位间距离较近（1～2cm）,因而可以同步检测更多的基因座，提高单次检测的信息量。③突变率低,SNP座位的遗传稳定性好,相对于STR具有一定的优势。④法医学应用研究评估，包括个体同一性，不同检材基质，不同保存条件、时间，不同的物理、化学及生物学因素对SNP分型的影响等问题需要研究。还有SNP的种属特异性、检测灵敏度等实际检测中常遇到的问题等。目前，法医物证学研究的热点是应用生物芯片技术检测SNP，重点在基因座选择、 群体资料调查、检测方法的建立。虽然尚在研究阶段，某些技术细节仍存在困难，但芯片技术的巨大潜力不容置疑。
SNP座位的等位基因间仅相差一个碱基，探针与靶DNA片段的杂交常会出现错配杂交产物，导致假阳性结果，影响着其在法医物证检验中的应用。Gill等(2001)设计一种等位基因特异性通用示踪引物,建立起多SNP座位复合扩增检测分型系统方法，基本上解决了这一难题。作者设计了两套引物，一套是起始物，先行扩增含有SNP座位的靶片段。另一套为检测引物，是针对二等位基因SNP基因座设计的。该方法设计的PCR体系，扩增产物长度不到100bp，相信更适用于腐败、陈旧和微量的法医生物学检材的分析鉴定。
近年来SNP的检测方法的研究有了多种探索，Divne等（2001）利用液相微测序技术建立起多SNP座位分析的方法，利用这一方法，一次分析了13个核基因组SNP和21个mtDNA的SNP基因座,样品包括部分实际案件材料及已知基因型的对照样品，均获较理想的结果。研究结果说明，方法建立后，可以增加被检测的SNP数，为法医鉴定提供一个灵敏、可信、快速的高鉴别能力的多SNP分型系统。Lareu等（2001）建立的DNA芯片技术分型SNP是利用Affymetrix417微阵列Affymetrix418微阵列自动扫描仪。作者检测了100个常染色体SNP和32个Y－SNP基因座，先将探针在一张载玻片上点样形成阵列，靶SNP的两等位基因扩增引物分别标记Cy3和Cy5，然后进行杂交。结果检测和型别判定由微阵列扫描仪完成。
生物芯片对mtDNA的分型技术也有一定的发展。Reynolds等用17条SSO探针对689个人的HVⅡ区的多态性进行了分析，还对五例案件的头发和血痕进行分析检测，认为该分析法可用于个人识别。Gabriel等用27条探针的微阵列对105个个体的HVⅠ/HVⅡ内的6个区进行了分型,建立了一个mtDNA单倍型数据库，并通过分析毛干及陈旧骨骼等实际案件检材，证明该方法可准确快速地用于法医鉴定中该类检材的分析。
4 生物芯片技术在法医物证鉴定中的应用前景
法医物证学学科发展一直在不断吸收其他相关学科的理论和技术，生物芯片技术的高信息量的优势极具吸引力。 在医学诊断领域，对SNP进行了大量专题研究，但法庭科学的要求与临床医学不同，应用研究尚在起始阶段。法医学应用面临的挑战是：①基因座的选择，通过群体调查确定基因频率,从多态性高低考虑,应选择频率在0.2～0.8范围内的SNP。②建立同步检测50个以上的复合检测系统，评估多SNP检测操作平台，大约包括10～50个PCR扩增反应，要求平衡、稳定地扩增，并有足量的产物。③检测灵敏度不低于10ng模板DNA。④质量控制体系,防止样品间交叉污染及其外来污染。作为一种高新技术，法医生物芯片检测的研究将会继续，是机遇，也是挑战。Gill（2001）在第19届国际法医遗传学会上对此发表了意见，认为SNP目前只有检测DNA序列变异的价值,以SNP代替目前常规应用的STR遗传标记目前只是一种推测。 现行的国家级的罪犯DNA数据库都是以STR为基础的，由于SNP与STR不能够兼容，如果以SNP替代STR将会带来许多难以克服的管理上的问题。Gill认为，在Y-SNP和mtDNA-SNP分型将在法医个体识别中占有一席之地，预期将是目前方法的一种补充，而不能替代现有的方法。也有学者认为目前的STR分型将会维持到2010年,取而代之的是生物芯片技术，这是一种较为乐观的估计。法医学鉴定有其自身的特点和要求，从目前的应用研究到成熟的标准化产品面市，尚需时日。
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